生物测定设计与相对效价测定的要点

BioPharm International  ·  第 29 卷，第 4 期  ·  2016 年  ·  页码 49–52  ·  Thomas A. Little 博士

在定义生物测定和相对效价时，美国药典（USP）指出^[1]：

“由于生物测试系统（包括动物、细胞、仪器、试剂以及日常和实验室间的差异）固有的变异性，效价的绝对测量比相对于标准品的活性测量变异更大。这导致了相对效价方法的采用。假设标准品和测试材料在生物学上相似，则应存在统计相似性（这是测试品与标准品相似性的结果），并且测试样品可以预期表现为标准品的浓缩或稀释。相对效价是通过比较测试品和标准品制剂的剂量-响应关系而获得的无量纲度量。”

本文旨在介绍相对效价生物测定中最常见的组成部分，并为测定开发、计算和控制提供一个框架或平台。它并非意在涵盖与生物测定相关的所有问题，而是涵盖相对效价计算和报告中的基本组成部分。

生物测定的目的与适用性

生物测定可以是体外、体内或离体实验，可用于多种目的，包括：

• 工艺开发、工艺表征和产品开发
• 原料药或制剂的产品放行测试
• 过程控制和中间体测试
• 稳定性和产品完整性测试

生物测定剂量响应

正确确定生物测定剂量响应稀释方案是生物测定最重要的方面之一。可以使用多种剂量响应策略，例如：

• 单剂量（不推荐）
• 双剂量（不推荐）
• 三剂量（不推荐）
• 四剂量（良好，但难以掩蔽饱和剂量）
• 五剂量（适用于平行线分析 [PLA] 和剂量掩蔽）
• 精细剂量（见图 1）或更多（适用于四参数 [4PL] 拟合和剂量掩蔽）

一般来说，应避免使用一、二、三剂量方案，因为它们难以控制变异，并且会在相对效价计算中带来问题。理想的剂量响应曲线是平行线分析（线性）的五点曲线，以及 S 形拟合的九点或更多剂量方案。对于 S 形曲线，理想情况下，在曲线的非活性或低响应部分应有三个点，在线性部分有三个点，在从系列稀释的对数或 log₁₀ 尺度的饱和区域有三个点。在平行线分析（非 S 形）中，五剂量方案在曲线的线性部分是理想的。

4PL 与 5PL 拟合

如果拟合 logistic S 形曲线，有两种常见的曲线拟合技术：四参数（4PL）和五参数（5PL）。四参数曲线假设曲线拟合的上部和下部区域对称，而五参数曲线假设上下渐近线的曲线形状不同。评估 4PL 拟合的残差可以指示曲线拟合技术是否合适，或者是否需要进行 5PL 拟合。如果 4PL 拟合良好，残差应呈随机性和正态性，并且在剂量响应范围内无系统模式。

异常值分析

在讨论异常值（见图 2）时，USP <1032>指出：”生物测定开发的统计要素包括数据类型、不同浓度下的响应测量、测定设计、统计模型、数据的预分析处理、数据分析方法、适宜性测试和异常值分析。这些构成了将用于估计测试样品效价的生物测定系统的组成部分。”

以下是推荐的异常值检测和剔除方法^[2]：

• 曲线拟合的学生化残差大于 2.575（99% 风险）
• 被剔除点的 z 分数为 3 或更大（99.73% 风险）

被剔除点对曲线的影响可通过检查 R² 和残差均方根误差（RMSE）的变化来评估。一般来说，在剂量曲线上不应剔除超过一个点或一个剂量。

变换和曲线加权

如果能够证明变换可以改善测定的线性度，则可以在稀释和测量响应两方面都进行数据变换。USP <1034>^[3]指出：”拟合统计模型以检测潜在异常值（在开发过程中选定），包括任何加权和变换。首先在不假设测试品和标准品曲线相似的情况下进行，但应包含设计结构的重要元素，理想情况下使用比用于评估相似性的模型对响应函数形式假设更少的模型。”

如果剂量响应范围内的变异缺乏同质性，加权可以减少相对效价测定的变异。通常，当变异在统计上显著不同时，使用每个剂量下残差的 1/方差。可以使用 Bartlett 或 Levene 的方差不相等检验来确定方差是否在统计上显著不同。通常推荐使用固定的 1/方差加权方法。加权适用于参比品和测试品。

用于平行线分析的掩蔽

在线性平行线分析中，建议掩蔽或剔除饱和测量值（见图 3）。仅剔除响应曲线的高剂量或低剂量（饱和）部分，根据剂量方案的不同，使用连续的三或四个剂量进行相对效价测定。掩蔽将消除平行线分析中的饱和效应（曲棍球棒效应）。

系统适用性和平行性评估

有多种技术可用于评估平行性。表 I 提供了评估平行性的方法总结。其他系统适用性标准包括已知对照品的测量、重复测量的相对变异（%CV）以及用于信号强度的曲线深度。

表 I：平行性和系统适用性评估方法总结。

相对效价的计算

相对效价的计算如公式 1 所示，并可能因测定而异。

公式 1： 相对效价 = (EC_{50[测试品]} / EC_{50[参比品]}) ×100 + CF_参比品 + CF_{参比品稳定性}

EC₅₀ 根据 4PL 约束拐点计算，并根据稀释因子是 log₁₀ 还是 log 变换进行反变换（反对数）（见公式 2）。

公式 2：log10 EC₅₀ = 10^拐点 
或 log EC₅₀ = Exp(拐点)

控制标准品对相对效价的影响

注意在公式 1 中，有一个校正因子（CF）应用于相对效价测定。CF_参比品 是对新参比品进行确认的校正因子，用于修正因参比品更换而导致的效价偏移。CF_{参比品稳定性} 是对参比品随时间损失效价的校正。未在效价计算器中包含这些校正因子将导致测定随时间推移变得过高或过低估计效价。

效价测定中的工作流程

图 4 展示了生物测定的良好工作流程。来自生物测定的数据应进行质量控制检查，所有可报告结果应发送至实验室信息管理系统（LIMS）。生物测定的关键参数和试剂应用于跟踪和趋势分析。

监测和控制相对效价

长期监测生物测定的性能至关重要。无约束的标准品 EC₅₀ 通常被认为是测定稳定性和一致性的最佳度量。为检测测定漂移是方法问题还是标准品问题，应与无约束的 EC₅₀ 进行比较。如果参比品和测试品都在漂移，则表明测定随时间发生了变化，但对相对效价没有影响。如果测试品稳定而参比品呈趋势性变化，则会影响相对效价，应进行纠正或选择新的参比品。

结论

生物测定是相对效价和生物活性的有力测试，但在测定设计和分析中需要谨慎，以确保它们能够可靠地指示效价的变化。测定验证^[4]将证明测定的准确性、重复性和线性，以及其在测量相对效价方面的适用性。在剂量响应选择、异常值检测和剔除、掩蔽、变换和加权方面的谨慎选择将使测定更加稳定和可重复。

参考文献

1. USP, <1032> Design and Development of Biological Assay, USP 38–NF 33 (USP, December 2015).
2. T. Little, BioPharm Intern 29 (1) (January 2016).
3. USP, <1034> Analysis of Biological Assays, USP 38–NF 33 (USP, December 2015).
4. USP, <1033> Biological Assay Validation, USP 38–NF 33 (USP, December 2015).

原文地址：Essentials in Bioassay Design and Relative Potency Determination | BioPharm International