我们之前讨论过4参数逻辑（4PL）模型。有时您可能会看到4PL方程略有不同的版本——它们在数学上都是等价的。但有一点需要注意：这四个参数的含义在不同版本之间可能有所不同。如果您在拟合4PL模型时得到的参数值与预期相差甚远，请检查您使用的4PL版本是否与您想的一致！我们在这篇关于4PL公式的博客中对此进行了更详细的探讨。
在此，我们将更详细地讨论连续响应数据的模型，特别是可能出现的一些问题。
4PL是一条对称曲线，从低剂量处的渐近线（恒定值）开始，呈S形上升，最终在高剂量处到达另一条渐近线。下图中展示了一个生物测定数据的4PL曲线示例。A和D是渐近线，EC50是C的反对数。B是”斜率参数”，与斜率成正比。
4PL模型的方程形式为：
y = D + (A – D) / (1 + (x / C)^B)
其中y为响应，x为原始剂量。
关键要点
- 4参数逻辑（4PL）模型是对称的，对许多生物测定效果良好，但在处理不对称数据时存在困难。5参数逻辑（5PL）模型增加了一个额外参数（E）来处理不对称性。
- 使用最小二乘法确定最佳拟合曲线，但有时会导致拟合效果不佳，特别是在所选模型与数据特征不匹配的情况下。4PL可能无法拟合不对称数据，而即使5PL在数据极端不对称时也可能不适用。
- 拟合优度检验有助于检测不良拟合。此外，斜率值极高或拟合不收敛等警示信号也表明可能存在潜在问题。调整剂量间距或使用内置检查功能的软件有助于防止误导性结果。
图1：4PL由4个参数定义
5参数逻辑模型
4PL通常能较好地拟合生物测定数据。但由于它是对称的，因此无法很好地拟合不对称数据。在这种情况下，常用的替代方案是5参数逻辑（5PL）模型。它与4PL类似，但增加了一个额外参数E，使其能够处理不对称性。5PL的方程，对于响应y为：
y = D + (A – D) / (1 + (x / C)^B)^E
与4PL一样，5PL从低剂量处的一条渐近线开始，到高剂量处的另一条渐近线结束。然而，从一条渐近线到另一条渐近线的曲线不是对称的。以下是一个示例：
渐近线仍然是A和D，B也仍然是斜率参数。然而，在5PL中，EC50不是C的反对数。它的计算公式为：
EC50 = C × (2^(1/E) – 1)^(1/B)
图2：5PL增加了一个额外参数E，用于控制曲线的不对称性
新参数E控制着不对称性：如果E等于1，曲线是对称的。对于较大的值，靠近A渐近线的曲线部分变得更陡峭弯曲，而靠近D渐近线的部分则较平缓；当E小于1时，情况则相反。
拟合过程
要理解使用4PL和5PL时可能出现的一些问题，有必要了解生物测定统计软件在”拟合”模型时做了什么。统计软件使用一种称为”最小二乘法”的方法进行拟合。该方法的优点是数学上简单，并且与数据服从正态分布的假设一致。
稳健回归是另一种替代方法，将在后续的博客中讨论。
顾名思义，最小二乘法拟合试图最小化”平方和”——即数据点与模型曲线之间距离的平方和。这是合理的，因为使这些距离变小将使曲线更接近数据，这正是我们想要的。
无法通过单一方程直接计算出4PL或5PL模型的最佳拟合。相反，生物测定统计软件首先对A、B、C和D（如果是5PL还包括E）的值进行粗略猜测，这些初始值可能离最佳拟合相去甚远。然后它尝试对拟合进行微调，并检查平方和是否减小了。如果减小了，它接受该变化并尝试另一个调整；如果没有，它尝试对曲线进行不同的调整。这一过程持续进行，直到无法找到能使平方和减小的变化，此时软件得出结论：已找到最佳拟合。
拟合中的问题
通常情况下，拟合过程效果良好。然而，在某些情况下它可能会给出意想不到的结果。
一个例子是，软件确定的”最佳”拟合仍然可能非常糟糕。当我们试图将生物测定数据拟合到不适当的模型时就会发生这种情况。例如，如果数据是不对称的，但我们试图拟合4PL，那么拟合不可能在所有地方都接近数据，因为4PL本质上是是对称的。另一个例子是，如果生物测定数据极端不对称，而我们试图拟合5PL。虽然5PL可以处理不对称性，但它能处理的不对称性有一个最大范围。图3展示了5PL模型可能实现的不对称性的完整范围。
图3：5PL模型拟合可能实现的不对称性的完整范围
上图中的所有曲线都是5PL，具有不同的E参数值（允许不对称的额外参数）。黑色曲线是E=1，此时5PL是对称的，虚线曲线是E的其他值。然而，不可能超越右侧的紫色实线曲线（E=0）或左侧的红色实线曲线（E=∞）。因此，如果您的生物测定数据比这更加不对称，则无法用5PL获得良好的拟合。
适当的拟合优度检验，例如F检验，有助于检查是否发生了这种情况。只要有两个或更多重复，F检验就可以用作任何模型的拟合优度检验。F检验比较两个量：”失拟误差”，用于度量拟合与生物测定数据之间的距离；以及”纯误差”，用于度量重复之间的平均差异。如果前者相比后者较大，则F检验的p值将较小，表明拟合效果不佳。
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另一个问题是，拟合可能接近数据，但模型曲线可能不符合预期。对于4PL，我们可能会得到像图4这样的曲线。
图4：一个失败的4PL模型拟合
这是怎么回事呢？
对于上面所示的生物测定数据，恰好出现了一个情况：当B增大时，平方和总是变得更小——但随着B的增大，变化越来越缓慢。从数学上讲，最佳拟合（实线）具有无穷大的B，这意味着模型曲线在到达EC50之前一直是平坦的，然后在EC50处突然跳变到另一条渐近线。
这种情况的一个特殊问题是，它可能不像上面的例子那么明显。大多数生物测定统计软件会多次调整拟合，不断增加B的值，但最终平方和的变化变得非常小，以至于软件认为已经达到最佳拟合，然后停止。
然后它会输出它已达到的任何B值，可能为10或20。这将产生陡峭的模型曲线，如图中的虚线曲线所示，但没有突然的跳变。可能没有任何明显的迹象表明出了问题。
为避免这个问题，请务必检查软件输出中的警告信息——在这种情况下，软件输出可能会显示类似”拟合未收敛”的信息——并考虑使用适用性标准来拒绝B值非常大的拟合。如果这种情况反复发生，可能需要减小剂量间距，以在曲线的陡峭部分获得更多数据。
Quantics的生物测定软件QuBAS会自动处理这个问题：它会专门检查看似最佳的拟合是否是一条合理的平滑曲线。
思考： 上面展示的生物数据真的总是出乎意料吗？Greulich等人在这篇有趣的论文中引发了我们Quantics团队的思考。
图4中4PL所显示的类似”跳变”也可能发生在5PL拟合中。图3中5PL的紫色曲线展示了另一个不同的例子，其中响应在达到某个剂量之前完全平坦，然后在达到该剂量时突然开始急剧上升。
然而，Greulich等人使用了如图5所示的简单数学模型来研究抗生素存在下的细菌生长，并发现了与紫色曲线非常相似的曲线，其方程与5PL极为相似。该论文的作者还发现他们的模型能较好地拟合实验数据。所以，也许这些”出乎意料”的拟合确实有可能发生？
